Para realizarse una punción lumbar, usted se recuesta de costado, con las rodillas hacia el pecho. Esta posición ayuda a ampliar los espacios entre los huesos de la parte baja de la columna vertebral de modo que la aguja pueda introducirse con más facilidad. Se aplica un anestésico (anestésico local) en la piel. Luego se coloca una aguja larga y delgada en el canal espinal para recoger una muestra de líquido cefalorraquídeo (CSF, por sus siglas en inglés). Es posible que su médico deba pasar a otra zona de la columna vertebral si es difícil obtener el líquido cefalorraquídeo.

El color, el recuento de glóbulos y la cantidad de proteínas, glucosa y otras sustancias se miden en la muestra de CSF. Es posible que se añada parte de la muestra a una sustancia que estimula la multiplicación de microbios (como bacterias o un hongo). Esto se llama cultivo. También se mide la presión del CSF durante el procedimiento.